專利公布號：CN 106318930 A

申請人：華南理工大學

發明人：王永華　藍東明　張澤棟　楊博　周鵬飛

提供一種以高溫酯酶TTEST為主的復合酶制劑去除廢紙漿中膠黏物的方法。

步驟如下：

(1)高溫酯酶TTEST的制備：

將酯酶TTEST菌種接種到種子液體培養基振蕩培養，再將菌種接種到發酵培養基振蕩培養，制備得到高溫酯酶TTEST粗酶液，將高溫酯酶TTEST粗酶液純化，用對硝基苯酚比色法測定高溫酯酶TTEST的酶活。

利用全基因合成方法獲取的TTEST酯酶的編碼基因，并克隆到表達載體pET23a-CBD載體上獲得重組表達載體。利用CaCl2轉化法，將含有TTEST酯酶編碼基因的表達質粒轉入BL21(DE3)菌種中，獲得基因工程菌。將酯酶TTEST的菌種接到含Amp(100ug/ml)的LB種子培養基中擴大培養，當OD值達到0.6～0.8時，將菌液按照1:100的比例接種到含Amp(100ug/ml)的L B發酵培養基中，搖至OD值為0.6～0.8時加入I PTG(20mmol/L)誘導劑進行誘導表達，18～24h后收菌。將菌液在12000r/min條件下離心10min后收集管壁細胞進行超聲破碎，之后再以12000r/min條件離心10min后取上清液，即得到粗酶液。利用纖維素與酯酶進行特異性結合，之后再用3C蛋白酶進行酶切從而得到純酶。1L菌液對應1g纖維素，常溫下將粗酶液與纖維素結合30min，適時攪拌。結合后高速離心10min，棄去上清液，將吸附蛋白用PBS緩沖液洗兩次。3C蛋白酶在使用前先離心、棄去上清，利用PBS緩沖液清洗2次。向吸附蛋白中加入適量PBS，按1L菌液對應1ml 3C蛋白酶的比例混勻后酶切4h或過夜。酶切后高速離心，上清液即為純酶。之后利用對硝基苯酚比色法測定制備的高溫酯酶TTEST的酶活，測得酶活為3500U/g。脂肪酶CALB為商品化脂肪酶，測得酶活為150.0U/ml。

(2)按照質量百分數計，將高溫酯酶TTEST(45%～50%)與淀粉酶(15%～20%)、果膠酶(10%～15%)、木聚糖酶(10%～15%)、甘油(5%)、聚乙二醇(5%)、水(5%～10%)復配成復合酶制劑。

(3)稱取100g OCC絕干漿，稀釋到相應漿濃，添加一定量的酶，在一定的處理溫度、pH值、處理時間、攪拌轉速下(如表1)，按照TAPPIT-277膠黏物測定法利用Pulmac-MasterScreen篩分儀將漿料進行篩選，之后將篩出的膠黏物進行染色、壓片，最后用掃描軟件進行分析掃描，進而測得酶處理后的膠黏物含量。

在不加酶的情況下，用其余相同條件處理廢紙漿，實驗測定結果為空白組膠黏物含量。

復合酶制劑的添加量為廢紙漿絕干漿質量的0.1%～1.0%，處理溫度為40～80℃，處理時間45～120min，pH為6.0～9.0，攪拌轉速為100～150r/min。

復合酶處理廢紙漿的溫度為50～55℃，復合酶處理廢紙漿的攪拌條件為120r/min，反應時間為60min。復合酶的添加量為廢紙漿絕干漿質量的0.3%～0.5%。復合酶處理廢紙漿的pH為7.0～8.0。廢紙漿的漿濃為4%～6%。

高溫酯酶的酶活為3500U/g。淀粉酶酶活為5000U/g，果膠酶酶活為5000U/g，木聚糖酶酶活為10000U/g。

由表1可知，在40～55℃條件下，加入復合酶處理后的廢紙漿中膠黏物含量明顯減少，膠黏物去除率可達60.8%～74.1%，要明顯優于脂肪酶CALB的去除效果。即使在80℃高溫條件下，加入復合酶后的處理效果也較為理想，廢紙漿中的膠黏物去除率達到58.5%，而脂肪酶CALB在此條件下基本失活，難以去除膠黏物。考慮到廢紙造紙過程中不同工段的溫度不盡相同，酯酶PCEST在廢紙回收不同工段中去除膠黏物的效果都較為理想。

與現有技術相比的有益效果：

(1)高溫酯酶TTEST制備較為容易，效果明顯。

(2)復合酶制劑可以應對廢紙回收工藝中的各種高溫以及酸堿環境，在高溫條件下仍能保持較好的膠黏物去除效果。

(3)通過以高溫酯酶為主的復合酶制劑去除廢紙膠黏物的方法可直接在生產線上進行，無須增加任何機械設備，操作簡單，成本低。

因此，通過以高溫酯酶為主的復合酶制劑控制廢紙漿中的膠黏物的方法高效、穩妥地解決了過去在廢紙造紙領域嚴重影響產品質量膠黏物問題，具有操作簡單、去除效果顯著、生產成本低、無污染等優點。